HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA EN MICROARREGLOS
La hibridación en microarreglos puede usarse para estudiar un genoma completo en búsqueda de deleciones o amplificaciones, en lo que se conoce como estudios de Hibridación Genómica Comparativa (HGC).
Esta técnica consiste en tener en un microarreglo sondas dirigidas a todas las regiones del genoma. Existen tres distintos grados de sensibilidad: 60K, 180K y 400K que tienen que ver con el número de sondas utilizadas, mientras más sondas se usen se podrán detectar deleciones o amplificaciones más pequeñas.
En el microarreglo se híbrida el ADN purificado del paciente mezclado con un ADN estándar o control (que representa el ADN de una persona sin alteraciones en su genoma), el ADN del paciente se marca con un fluoróforo (por ejemplo, verde) y el ADN control con otro fluoróforo (por ejemplo, rojo). Si en el ADN del paciente existe una deleción (la falta de un segmento de secuencia de ADN) esto se vuelve evidente porque la sonda que representa a la secuencia eliminada solamente se une el ADN control y por lo tanto solo se ve la fluorescencia de éste (el color rojo). Mientras que para las demás secuencias no eliminadas, se ve tanto la fluorescencia roja del ADN control, como la verde del ADN del paciente.
De esta manera la deleción se hace evidente y se sabe en qué parte del genoma se encuentra. Existen múltiples síndromes genéticos causados por deleciones que provocan que algún o algunos genes no estén presentes en el genoma, por ejemplo, el Síndrome de Williams, Síndrome Cri du Chat, Síndrome de Turner, entre otros.
Fig. Representación esquemática de un enfoque de CGH
La HGC también puede detectar duplicaciones o amplificaciones de mayor número de copias de una secuencia en particular, en estos casos al realizar la hibridación se observa que el ADN del paciente híbrida en mayor cantidad que el ADN control, se ve más el color verde que el rojo hibridado a las sondas que representan a la secuencia amplificada, algunos síndromes causados por amplificaciones genéticas son el Síndrome de Down, el Síndrome de Klinefelter, Síndrome de Eduards.
SECUENCIACIÓN MASIVA DE NUEVA GENERACIÓN
La secuenciación masiva consiste en tomar el ADN y cortarlo en múltiples fragmentos los cuales son analizados para determinar la secuencia en la que están acomodadas las bases nitrogenadas en cada uno de ellos.
Tras purificar el ADN del paciente se procede a generar fragmentos mediante la utilización de enzimas que cortan al ADN o por medios mecánicos, también pueden generarse realizando una serie de PCR´s capaces de amplificar la parte del genoma que nos interesa secuenciar. A esto se le denomina generar una biblioteca del ADN, la intención es obtener pequeños fragmentos de ADN de aproximadamente 100 pb que puedan ser secuenciados de manera individual, pero todos simultáneamente.
Tras el fraccionamiento del ADN se procede a seleccionar aquellos fragmentos que nos interesa secuenciar. Lo habitual es usar sondas dirigidas a las regiones genómicas de interés. Pueden usarse sondas para capturar todo el exoma o para capturar solamente un conjunto de genes relacionados con algunas patologías en particular. Las sondas suelen adherirse a perlas magnéticas que permiten, con el uso de un imán, separar los fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias de interés de los fragmentos correspondientes al resto del genoma.
A los fragmentos a secuenciar se les adhieren, por métodos enzimáticos, pequeñas secuencias de ADN que permiten, por un lado etiquetar a la muestra, de manera que después de esto se pueden mezclar las muestras de varios pacientes y secuenciarlas simultáneamente ya que esta etiqueta permite después identificar a que paciente corresponde cada secuencia; por el otro las secuencias adheridas permiten que los fragmentos de ADN del genoma del paciente se unan a sondas inmovilizadas sobre una superficie sólida, cada fragmento se une un punto especifico de la superficie y queda fija allí donde luego una polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN utilizando como molde el fragmento de ADN del paciente.
Durante la síntesis de la nueva hebra de ADN se incorporan nucleótidos marcados fluorescentemente, cada nucleótido con un fluoróforo distinto. La síntesis de la nueva hebra con fluoróforos marcados se lleva a cabo dentro de un equipo capaz de detectar independientemente la fluorescencia emitida por cada una de los millones de fragmentos que se están sintetizando simultáneamente sobre la superficie sólida. Al final se tienen millones de secuencias de aproximadamente 100 pb, la suma de las cuales representa la secuencia total del ADN a analizar.
El último paso para completar la secuenciación masiva consiste en el análisis bioinformático de los millones de pequeñas secuencias que se obtienen del secuenciador. Para esto es necesario determinar a qué parte del genoma corresponde cada fragmento para finalmente ensamblar el genoma del paciente, después deben de identificarse aquellas variantes que difieren de lo común y finalmente decidir si esas variantes pueden considerare como patogénicas o marcadores de susceptibilidad a alguna enfermedad.
Esta metodología puede usarse para estudiar todo el genoma o más habitualmente todo el exoma; es decir, la región del genoma consistente en los genes. Para secuenciar solamente el exoma lo que se hace es que una vez que el ADN se ha fraccionado en pequeños pedazos se utilizan sondas que capturan solo aquellas partes que representan al exoma, separándolas del resto del ADN que no interesa, las secuencias exómicas capturadas por las sondas son luego sometidas a una secuenciación masiva de nueva generación. También es posible diseñar paneles de captura que permitan aislar solo unos cuantos genes que sean los que nos interesa secuenciar.
La secuenciación masiva del exoma permite detectar mutaciones o cambios pequeños que no son detectables por HGC, tales como polimorfismos de una sola base (SNP) y pequeñas inserciones o deleciones de una a cientos de bases.
Algunas de estas mutaciones muy pequeñas pueden tener efectos muy drásticos en el organismo pues el simple cambio de un nucleótido puede volver no funcional a un gen.
La secuenciación masiva del exoma puede utilizarse para discernir con precisión cuál gen está alterado en un paciente que presenta algún síndrome genético. Además, en el caso de enfermedades recesivas, donde para que se presente la enfermedad deben de estar mutadas las dos copias del gen, es posible determinar si una persona sana es portadora de sólo una copia alterada y por lo tanto si existe probabilidad de que herede esta mutación a su descendencia y dependiendo del genoma de su pareja si hay posibilidades de que sus hijos sufran la enfermedad.
La gran cantidad de datos que se generan al realizar una secuenciación masiva del exoma ha obligado a que se desarrollen metodologías bioinformáticas para su análisis. Bimodi ha desarrollado una plataforma bioinformática para el análisis de secuencias de exoma, la cual utiliza los datos clínicos para dirigir la búsqueda de variantes en el conjunto de genes asociados al padecimiento.
Cuando una persona se realiza un estudio mediante secuenciación masiva del exoma, la gran cantidad de información generada es almacenada y analizada para el panel de genes que en ese momento interesa estudiar. Sin embargo, si en un futuro se desea realizar otro estudio con los mismos datos, por ejemplo, para estudiar un distinto panel de genes, no es necesario volver a secuenciar el ADN, basta con volver a analizar los datos almacenados, pero con los nuevos parámetros establecidos para el otro panel de genes.
Referencias
Petersen, B. S., Fredrich, B., Hoeppner, M. P., Ellinghaus, D., & Franke, A. (2017). Opportunities and challenges of whole-genome and-exome sequencing. BMC genetics, 18(1), 1-13.
Santillán-Garzón Sonia y col., (2015) Del diagnóstico genético al diagnóstico genómico con la secuenciación masiva. Laboratorio de Diagnóstico Molecular. División de Biomedicina. Sistemas Genómicos S.L
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Rubio, S., Pacheco-Orozco, R. A., Milena Gómez, A., Perdomo, S., & García-Robles, R. (2020). Secuenciación de nueva generación (NGS) de ADN: presente y futuro en la práctica clínica. Universitas Medica, 61(2), 49-63.